论文摘要
第一部分：吸烟对重型颅脑损伤伴发急性肺损伤的影响目的：探讨吸烟对重型颅脑损伤伴发急性肺损伤的影响。方法：选择162例我院于2010年1月至2011年12月收治的重型颅脑损伤患者,其中男性139例,女性23例,年龄18～72岁,平均年龄（44.86±13.51）岁。其中交通事故伤85例,高空坠落伤30例,跌倒伤28例,暴力伤8例,其他11例。根据是否吸烟分为吸烟组（74例）和非吸烟组（88例）。于入院后第5天依据急性肺损伤诊断标准判断重型颅脑损伤患者是否患有急性肺损伤,比较吸烟组与非吸烟组急性肺损伤发病率。于入院后第0、5天检测重型颅脑损伤患者肺功能。肺容量指标：呼吸频率（Breathing frequency,BF）、肺活量（Vital capacity, VC）;肺通气量指标：用力呼气一秒量（Forced expiratory volume in the first second,FEV1）、用力呼气肺活量（Forced expiratory vital capacity,FVC）、最大分钟通气量（Most minute ventilation,MMV）;小气道指标：最高呼气流速（Peak expiratory flow,PEF）。于入院后第0、5天采集肺泡灌洗液,按照试剂盒说明书检测肺泡灌洗液上清液中的肿瘤坏死因子-α （Tumor necrosis factor-alpha,TNF-a）,白介素-8（interleukin-8,IL-8）和丙二醛（Malondialdehyde MDA）水平及超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性。结果：1.吸烟组中有26例重型颅脑损伤患者伴发急性肺损伤,发病率达到35.14%,而非吸烟组中仅有16例伴发急性肺损伤,发病率为18.18%,两组差异具有统计学意义（P=0.019）。2.入院后第0天,吸烟组的BF, VC、 FEV1、 FVC、 MMV、 PEF均低于非吸烟组,其中,两组的MMV、PEF的差异具有统计学意义（P<0.05）。入院后第5天与入院后第0天比较,两组患者的肺功能均呈下降趋势,吸烟组的下降趋势较非吸烟组更为明显。3.入院后第0天,吸烟组的TNF-α. IL-8、MDA水平均高于非吸烟组,差异具有统计学意义（P<0.05）；吸烟组的SOD活性低于非吸烟组。入院后第5天与入院后第0天比较,两组患者的TNF-α. IL-8、 MDA水平均呈上升趋势,吸烟组的上升趋势较非吸烟组更为明显；两组患者的SOD活性呈下降趋势,吸烟组的下降趋势较非吸烟组更为明显。入院后第5天,两组的4个指标具有显著性差异（P<0.05）。结论：与非吸烟组相比较,吸烟组的重型颅脑损伤患者的基础肺功能和SOD活性较低,fNF-α. IL-8和MDA水平较高；伤后肺功能和SOD活性降低以及TNF-α、IL-8和MDA水平升高更为明显,急性肺损伤发病率更高,可能与吸烟和颅脑损伤协同促进炎症反应和氧化应激相关。第二部分：穿心莲内酯在被动吸烟诱发肺损伤中的保护作用目的：本部分研究穿心莲内酯对吸烟诱导的小鼠肺部急性炎症反应的作用。方法：本研究所用实验动物为32只清洁级成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄）,体重为18-20g。将实验小鼠随机分为4组（每组8只）,分别为：正常对照组（C）、烟草烟雾暴露组（CS）、用溶质DMSO处理的烟草烟雾暴露组（CS+DMSO）和穿心莲内酯处理的烟草烟雾暴露组（CS+A）。穿心莲内酯是在烟草烟雾暴露前1h通过腹腔内注射途径给予,剂量为1mg/kg体重。将模型组小鼠置于被动吸烟箱中,每天被动吸烟9支,连续4天。对照组小鼠置于相同的实验条件下只是不接受被动吸烟处理。小鼠于实验第5天经腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）,并作肺部组织学分析。对BALF中细胞进行计数,并经Wright-Giemsa染色进行细胞分类记数。ELSIA法分析BALF中肿瘤坏死因子-α （Tumor necrosis factor-alpha,TNF-a）,白介素-6（Interleukin-6,IL-6）,巨噬细胞炎症蛋白-2（Macrophage inflammatory protein-2, MIP-2）,白介素10（interleukin-10,IL-10）,LPS诱导CXC趋化因子（LPS-induced CXC chemokine, LIX）,干扰素γ （interferon-γ,IFN-γ）的水平。并对肺组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性进行测定。体外研究中,肺上皮细胞A549细胞作为细胞模型。用DNA片段化法分析穿心莲内酯对烟草烟雾诱导的A549细胞凋亡的影响,并用Western blot法分析穿心莲内酯对烟草烟雾介导的凋亡相关蛋白的表达的影响。结果：HE染色显示,被动吸烟组小鼠肺部毛细血管充血,肺泡出血；肺泡壁稍增厚；肺泡腔内充满大量单核／巨噬细胞,多形核白细胞等炎症细胞,以及大量渗出液。DMSO处理对吸烟诱导的肺部急性炎症反应没有明显影响。而穿心莲内酯处理组小鼠肺泡炎症轻,肺泡腔中炎症细胞及渗出液较少。穿心莲内酯能够抑制吸烟诱导的肺部炎症反应还表现为：穿心莲内酯能够显著抑制吸烟诱导的小鼠BALF中总细胞,单核／巨噬细胞,中性粒细胞以及淋巴细胞的数目的增加,减少吸烟介导的小鼠BALF中肿瘤坏死因子-a,白介素-6和巨噬细胞炎症蛋白-2的分泌,以及降低吸烟诱发的肺部髓过氧化物酶的活性。体外结果显示,烟草烟雾处理能够促进A549细胞的凋亡,而穿心莲内酯能够显著抑制烟草烟雾诱导的A549细胞的凋亡。结论：穿心莲内酯能够抑制吸烟诱导的小鼠肺部的急性损伤；能够保护烟雾烟草介导的肺上皮细胞A549细胞的凋亡。第三部分：穿心莲内酯在被动吸烟诱发肺损伤中作用机制目的：深入揭示穿心莲内酯影响吸烟诱导肺损伤的相关分子机制,重点探讨血红素加氧酶.1（Heme oxygenase-1, HO-1）通路对该药物发挥保护作用的贡献。方法：在体外研究中肺上皮细胞A549细胞作为细胞模型。利用RT-PCR和Westernblot法研究烟草烟雾和穿心莲内酯对A549细胞中HO-1mRNA和蛋白表达的影响。本研究所用实验动物为32只清洁级成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄）,体重为18-20g。将实验小鼠随机分为4组（每组8只）,分别为：正常对照组（C）、烟雾暴露组（CS）、穿心莲内酯处理组（A）和穿心莲内酯+ZnPP组（A+Z）。穿心莲内酯是在烟雾暴露前1h通过腹腔内注射途径给予,剂量为1mg/kg体重。ZnPP为一种很强的HO抑制剂,本文应用其阻断HO-1通路。ZnPP在穿心莲内酯注射之前1h通过腹腔注射方式给予,剂量为10pμmol/kg体重。对照组小鼠通过腹腔注射给予等量的生理盐水。将模型组小鼠置于被动吸烟箱中,每天被动吸烟9支,连续4天。对照组小鼠置于相同的实验条件下只是不接受被动吸烟处理。小鼠于实验第5天经腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）,并作肺部组织学分析。PCR和Westernblot用来检测小鼠肺组织中HO-1RNA和蛋白质的表达情况,并对肺组织HO-1酶活性进行测定。对BALF中细胞进行计数,并经Wright-Giemsa染色进行细胞分类记数。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定BALF总蛋白浓度。ELSIA法分析BALF中瘤坏死因子-α （Tumor necrosis factor-alpha,TNF-a）,白介素-6（Interleukin-6, IL-6）和巨噬细胞炎症蛋白-2（Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2）的水平。对肺组织和BALF中的MDA水平进行测定。并对BALF中LDH的活性以及肺组织中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）,过氧化氢酶（Catalase, CAT）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性进行测定。Western blot法检测穿心莲内酯对信号传导及转录活化子3（signal transducer and activator of transcription3, STAT3）通路活化的影响。结果：烟草烟雾处理和穿心莲内酯预处理显著增加HO-1mRNA和蛋白表达。而且这种诱导作用呈剂量依赖关系,这提示HO-1在烟草烟雾诱导细胞损伤过程中可能具有保护作用。HE染色显示,被动吸烟组小鼠肺部毛细血管充血,肺泡出血；肺泡壁稍增厚；肺泡腔内充满大量单核/巨噬细胞,多形核白细胞等炎症细胞,以及大量渗出液。DMSO处理对吸烟诱导的肺部急性炎症反应没有明显影响。而穿心莲内酯处理组小鼠肺泡炎症轻,肺泡腔中炎症细胞及渗出液较少,表明穿心莲内酯能够抑制吸烟诱导的肺部炎症反应。而用ZnPP阻断HO-1通路后,穿心莲内酯的保护作用被逆转。这说明穿心莲内酯对吸烟诱导肺部炎症的抑制作用依赖于HO-1通路活化。另外,穿心莲内酯能够抑制吸烟诱导的肺部炎症反应还表现为：穿心莲内酯能够显著抑制吸烟诱导的小鼠BALF中总细胞,单核/巨噬细胞,中性粒细胞以及淋巴细胞的数目的增加,减少吸烟介导的的小鼠BALF总蛋白浓度,肿瘤坏死因子-a,白介素-6和巨噬细胞炎症蛋白-2的分泌,减少吸烟诱导的肺组织和BALF中的MDA水平。以及降低吸烟诱发肺组织中超氧化物歧化酶,谷胱甘肽过氧化物酶,过氧化氢酶和髓过氧化物酶的活性和BALF中LDH的活性。而穿心莲内酯介导的这些保护吸烟诱导肺部炎症反应的作用均随着ZnPP抑制HO-1信号通路而被逆转,提示HO-1在穿心莲内酯对被动吸烟诱导的肺氧化应激、炎症及损伤的保护效应中起着重要的作用。穿心莲内酯处理显著提高吸烟小鼠肺组织中STAT3磷酸化水平,而对总STAT3蛋白影响不明显,这表明穿心莲内酯可促进肺组织STAT3通路活化。穿心莲内酯对STAT3通路的活化作用能够被ZnPP抑制,这提示STAT3可能位于HO-1通路下游。结论：穿心莲内酯可诱导肺组织HO-1表达及活性增加。HO-1表达上调介导穿心莲内酯对被动吸烟诱导肺氧化应激、炎症及损伤的保护效应。HO-1在被动吸烟诱导肺损伤中的抗炎、抗氧化活性与激活STAT3通路有关。