论文摘要
Tet-Off/Tet-On系统是一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系,它是用大肠杆菌Tn10转座子中四环素操纵子原理来实施调控的。Tet-Off/Tet-On系统是比较成熟的真核生物外源基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、开/关较严密等特点,已被成功地应用于细胞和转基因小鼠基因诱导表达的研究。c-myc是一种原癌基因,它是禽类骨髓瘤病毒v-myc的细胞同源序列,其编码的蛋白是核内特异性DNA结合蛋白。c-myc加速了G1-S细胞周期进程,从而促进细胞增殖,形成肿瘤;还刺激细胞凋亡,c-myc是一个B细胞凋亡和啮齿类动物体内胰岛分泌减少的强有力的引发者。本研究首先应用RT-PCR技术,从人的宫颈癌细胞中成功扩增出预期大小为1.32Kb的c-myc cDNA的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pTZ57R/T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该基因的克隆pTZ57R/T-c-myc。测序后将c-myc基因亚克隆入Tet-On系统的pTRE2载体中,获得pTRE2-c-myc重组载体。为了便于转基因细胞的筛选,我们将pCEP4上的Hyg酶切补平后克隆到同样酶切补平的pTRE2-c-myc载体,获得pTRE2-c-myc-Hyg。用pTet-On质粒转染CHO细胞,通过G418筛选获得表达Tet-On系统调节元件rtTA的阳性细胞CHO-pTet-On,经过有限稀释法获得16个转pTet-On基因的细胞单克隆。RT-PCR检测rtTA的表达后,将pTRE2-c-myc-Hyg基因转染能稳定表达rtTA的单克隆细胞,潮霉素筛选获得能诱导表达c-myc基因的CHO-pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg细胞,通过细胞亚克隆后得到转pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因细胞的单克隆15个。强力霉素（DOX）诱导转基因细胞后,RT-PCR、间接免疫荧光检测到c-myc的表达。Western Blot检测到com-myc基因
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