论文摘要
近年,随着手术、化疗、放疗水平的提高及生物靶向治疗的应用,多种肿瘤的疗效有了很大提高。但伯基特淋巴瘤（BKL）的疗效仍举步维艰。BKL的特点是恶性程度高,侵及范围广,早期复发病例易产生继发性耐药。应用目前常用的联合化疗方案,患者3年无病生存率（DFS）不足50%。在传统治疗的基础上,如何应用高效低毒的靶向药物,减少BKL的复发与耐药,是我们的思考所在。目前,对脂类代谢的研究表明,神经鞘脂类不仅是细胞膜的结构组成部分,而且是重要的信号分子。其中,鞘氨醇激酶-1（SPK1）是调节鞘磷脂代谢平衡的一种重要蛋白激酶,其催化产物1-磷酸鞘氨醇（S1P）可作为第一/第二信使参与多种信号转导途径。机体中,SPK1-S1P以精密的方式调控着生殖生育、血管发生、心脏发育、变态反应及多种肿瘤的发生发展。由此我们推断,SPK1-S1P信号可能参与对BKL疾病发生、发展的调控作用。为此我们开展了SPK1-S1P信号调节BKL的作用及相关机制的研究,旨在评价SPK1-S1P信号是否对BKL细胞的生物学特性具有调控作用,探讨SPK1-S1P信号是否通过级联在BKL异常活化的MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT3信号通路而发挥其调控作用,从而为SPK1-S1P信号在BKL临床治疗中的应用潜能提供实验依据。首先,我们利用RT-PCR方法,检测了BKL细胞系Ramos细胞中SPK1-S1P信号相关分子的表达情况。结果表明,Ramos细胞表达SPK1及S1P受体的5个亚型即Edg-1/S1P1、Edg-3/S1P3、Edg-5/S1P2、Edg-6/S1P4及Edg-8/S1P5。由此提示我们,SPK1-S1P信号可能对BKL细胞的生物学特性具有调控作用。接着,我们进行了SPK1-S1P信号对BKL细胞生物学特性调控作用的研究。应用CCK-8法,我们检测了外源S1P对Ramos细胞增殖能力的影响。结果显示,与空白对照组相比,外源S1P 0.01～2.5μmol/L作用于Ramos细胞24h、48h、72h,细胞增殖能力无显著改变。利用细胞盒扩散技术,我们研究了外源S1P对Ramos细胞侵袭性的调控作用。结果表明,S1P 0.1～2.5μmol/L作用于Ramos细胞6.0h,可促进细胞迁移,并具有量效关系,在1.0μmol/L剂量促迁移作用达到峰值,与空白对照组相比可提高细胞趋化性约2倍。为了研究外源S1P对Ramos细胞凋亡的调控作用,我们建立了地塞米松（DEX）诱导Ramos细胞凋亡的模型。结果,DEX 10.0μmol/L可成功诱导Ramos细胞凋亡,凋亡比例由单纯乏血清组的11.0%升高至33.5%。如在加入DEX前以S1P 1.0μmol/L预处理细2.0h,则可使细胞凋亡比例由DEX组的24.5%下降至10.6%。上述实验结果表明,外源S1P可促进BKL细胞迁移,并对DEX诱导的细胞凋亡具有保护作用。SPK1是一种与细胞生命活动调节密切相关的蛋白激酶,是调控S1P生成的限速酶。为了明确SPK1-S1P对Ramos细胞生物学特性的调控作用,我们采用RNA干扰技术使SPK1基因沉默,从负调控角度证实其调控作用。首先,我们扩增、纯化、收获了纯度为1.37、感染滴度为2.0×1010IU/ml携带SPK1特异性干涉序列的重组腺病毒Ad-H1-SPK1。应用Western印迹法及γ-32P掺入法检测到Ad-H1-SPK1感染Ramos细胞48h后,可使该细胞蛋白表达量下降34%,SPK1酶活性下降56%,表明干涉效果较好,可用于进一步实验研究。细胞生物学特性实验研究表明,Ad-H1-SPK1感染Ramos细胞48h后,较空病毒Ad-H1组,细胞增殖能力无明显改变,但迁移能力明显受到抑制。利用SPK特异性抑制剂二甲基鞘氨醇（DMS）处理Ramos细胞,发现DMS可使细胞凋亡比例明显升高。此部分实验,通过干涉或抑制Ramos细胞的SPK1,从负调控角度验证了SPK1-S1P对Ramos细胞迁移、凋亡生物学特性的调控作用。基于上述实验结果,我们以外源S1P处理Ramos细胞,结果S1P可上调MAPK、Akt、STAT3的磷酸化水平,这种上调作用具有明确的量效性（峰值浓度0.25～0.5μmol/L）和时效性（峰值时间20～30min）。由此表明,多种信号途径均参与S1P对Ramos细胞生物学特性的调控作用。S1P对Ramos细胞的凋亡具有保护作用,为明确其机制,我们以外源S1P处理该细胞,结果S1P呈量效性、时效性上调髓细胞白血病1蛋白（Mcl-1）表达,峰值浓度为0.5μmol/L,峰值时间为45min。以MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT信号通路的特异性阻断剂PD98059、Wortmannin和AG490阻断上述通路后,S1P上调Mcl-1表达的作用被部分阻断,表明MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT等多条信号通路参与了S1P的抗凋亡作用。Ramos细胞表达S1P受体的5个亚型,为明确受体亚型在参与调控Mcl-1表达中的作用,我们用G蛋白偶联受体阻断剂白喉毒素（PTX）、Edg-1/S1P1选择性激动剂SEW2871、Edg-5/S1P2选择性抑制剂JTE-013、Edg-3/S1P3选择性抑制剂CAY10444预处理细胞。结果,CAY10444 10μmol/L可明显抑制S1P诱导的Mcl-1表达上调,而其它受体阻断剂的作用不明显。由此表明,S1P主要是通过PTX非敏感的Edg-3上调Mcl-1的表达。综上所述,本研究表明Ramos细胞表达SPK1及S1P受体的5个亚型;外源S1P可促进Ramos细胞迁移,并对DEX诱导的凋亡具有保护作用;干涉或抑制Ramos细胞的SPK1表达,可抑制细胞的迁移能力,并诱导细胞凋亡;外源S1P通过激活MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT等多条信号通路来实现对Ramos细胞生物学特性及Mcl-1表达的调控;S1P通过其Edg-3受体来保护细胞免于凋亡。由此初步明确了SPK1-S1P对BKL细胞生物学特性具有调控作用,初步阐明了干涉SPK1-S1P信号或特异性阻断Edg-3有可能成为治疗BKL的新策略。
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