论文摘要
前言脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后,其永久性的功能丧失是由于上行和下行的轴突被离断而缺乏成功的再生所导致。轴突再生的失败,目前基本上归因于成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）中抑制再生的环境因素,在一个损伤后的CNS中,轴突尝试再生将面临髓磷脂关联的抑制因子,以及胶质瘢痕所形成的物理屏障。在SCI中心,几种髓磷脂关联的轴突再生抑制因子,如髓磷脂-Nogo-A,髓磷脂关联糖蛋白（MAG）,少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）,以及胶质瘢痕中的各种抑制性细胞外基质分子,如硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）,NG2,aggrecan及brecican等,已被证实在损伤的脊髓环境中,对于抑制轴突再生起到关键作用。在严重的SCI中,如脊髓完全性横断,脊膜破损,将导致显著的纤维浸润,大量胶质细胞混杂于侵入的结缔组织中。由反应性星形胶质细胞产生的CSPGs是抑制性的细胞外基质分子家族中的主要一种。在很多活体实验中,Chondroitinase（chABC）已被证实能有效地将CSPGs从SCI处清除并创造一个有利于再生的环境。研究者们采用一些联合治疗措施包括将各种细胞性/非细胞性移植物置于SCI点,同时结合其他药物治疗以促进轴突再生已取得了一定成效。例如,通过Schwann细胞架桥和嗅觉神经包绕的胶质移植物与chABC联合治疗,自体外周神经移植架桥和经chABC修饰后的基质,以及在SCI点移植入成纤维细胞架桥（成纤维细胞经基因修饰可分泌神经生长因子）等。目前认为,促进SCI后轴突再生的比较有前景的治疗措施之一,是提高cAMP水平。cAMP发挥该效用的前提是需要激活转译因子磷酸性cAMP反应元件结合蛋白（pCREB）,激活的CREB能够克服髓磷脂相关的轴突再生抑制因子从而促进活体的脊髓轴突再生。β2-肾上腺素受体激动剂Clenbuterol,可提高神经细胞中cAMP水平。改善脊髓挫伤后的运动功能恢复。电泳迁移率定量分析显示,Clenbuterol或高水平的cAMP可诱导CCAAT/增强子粘合蛋白δ（C/EBPδ）与pCREB的增加。在本实验中,我们试图明确在长期存活的SCI模型中,不应用任何移植物进行架桥的情况下,在SCI点使用chABC酶降解CSPGs合并Clenbuterol治疗,能否促进轴突再生并跨越SCI处胶质瘢痕。实验方法在本实验中,我们采用两种SCI模型。第一种采用特殊的保留硬脊膜的SCI模型,即使用特制的手术刀在硬脊膜内完成大鼠的第7颈段脊髓单侧半横切,将硬脊膜的损伤控制在最小范围以减小结缔组织浸润、胶质瘢痕形成,用以观察Clenbuterol能否提供一个有利于再生的局部环境以及促进离断的轴突再生并穿越SCI点。成年Wistar大鼠（n=10-12）接受硬脊膜内的第7颈段脊髓（C7）单侧半横切显微手术。Clenbuterol以9 mg/L的剂量加入饮用水中,而对照组未给予任何治疗。采用Cylinder试验和患肢抓力试验观察运动功能的恢复状况。对于逆行神经示踪,在行为学观察期（6周）结束后,大鼠接受第二胸段脊髓处椎板切开术,4%Fluorogold微量注射进入红核脊髓束,一周后被处死。第二种模型中,各组Wistar大鼠（n=5-8）在第10胸段脊髓（T10）给予破坏脊膜的完全性横切术,然后,在SCI处给予chABC和/或Clenbuterol（9mg/L,加入饮水中）,或者未给予任何治疗。在SCI后,采用BBB评分标准,连续12周评价其后肢运动功能。行为学观察期结束后,在第13胸髓节段给予4%荧光金（Fluorogold,FG）用于逆行神经示踪。实验结果在C7脊髓单侧半横切实验中,运动功能逐渐恢复,从SCI后第3周开始,Clenbuterol治疗组显著优于对照组（最终患肢抓力:403.45±19.82g vs 335.13±13.48g,p＜0.05）,在Cylinder试验中,双侧前肢共同使用触壁的百分比,Clenbuterol组显著高于对照组（43.39%±5.85%vs 19.42%±6.61%,p＜0.05）。Clenbuterol治疗显著地降低了SCI后继发性组织损伤,提高了pCREB阳性细胞核在整个SCI点的表达水平。逆行神经示踪显示,与对照组相比,Clenbuterol显著地促进了红核脊髓束轴突的再生。在T10脊髓完全性横断性损伤模型中,其结果表明,应用chABC治疗可减少胶原蛋白浸润,减少胶质瘢痕的长度,并可显著降解CSPGs（p＜0.05）。与未治疗组对比,只有Clenbuterol+chABC组显示出有统计学意义的运动功能改善,最终BBB评分为3.94。脊髓完全性横断性损伤后,病理结果显示,在SCI中心无任何正常的中枢神经组织结构保留,我们采用抗体RT97作为轴突的标记物,观测在胶质瘢痕中的再生轴突密度。在脊髓横断切片上,SCI中心及距中心头侧和尾侧各500μm处,其轴突密度各组分别为:Clenbuterol+chABC组,5801.3±413.3/mm2,7178±494.4/mm2,和6496.2±205/mm2,显著高于未治疗组:4035.9±492.2/mm2,4416.6±605.8/mm2及4136.3±532.1/mm2（p＜0.05）。逆行神经示踪结果显示,仅于Clenbuterol+chABC组动物脑中检测到FG标记的阳性神经元。Clenbuterol治疗在整个SCI处增加了pCREB阳性细胞核的表达。完全性损伤后的脊髓瘢痕内更加类似于外周神经形态,再生的轴突由Schwann细胞形成髓鞘而不是由少突胶质细胞形成。结论1、在硬脊膜破损、结缔组织浸润被降至最低程度的情况下,减少SCI后继发性神经组织缺失,激活pCREB以克服阻碍轴突再生的抑制因子,从而促进轴突再生,改善运动功能,是β2-肾上腺素受体激动剂Clenbuterol可能的作用机制之一。2、Chondroitinase可降低脊髓完全性横切后结缔组织的浸润,缩小胶质瘢痕,并有效地清除轴突再生的抑制因子CSPGs,为神经功能恢复和轴突再生提供了有利的局部环境。3、在不给予任何细胞性/非细胞性移植物的情况下,通过在SCI处酶降解CSPGs,结合Clenbuterol治疗可促进轴突再生,为脊髓损伤的治疗提供了新的思路。
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相关论文文献
- [1].Chondroitinase对成年大鼠脊髓完全性横断损伤后胶质瘢痕的影响[J]. 解剖科学进展 2014(02)