论文摘要
高糖诱导内皮细胞线粒体活性氧族（reactive oxygen species,ROS）的过度生成是包括糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）在内的糖尿病并发症的最主要的分子学机制。在2型糖尿病状态下内皮依赖的血管舒张作用受到损害。肾小球胞外基质（extracelluar matrix,ECM）过度生成和降解障碍导致ECM沉积。Urocortin（UCN）是一个40个氨基酸的多肽,属于促肾皮质激素释放激素（corticotrophin releasing factor,CRF）家族的一员。UCN抑制内皮细胞活性氧族的释放,诱导内皮依赖的大鼠冠状动脉的舒张;抑制内皮细胞增殖,下调VEGF表达;诱导绒毛膜滋养层细胞、羊膜上皮细胞、合包体滋养层细胞分泌基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase,MMP-9）,后者与基质降解密切相关。这些报道提示UCN可能与DN的发生发展有一定关联。本文采用肾小球系膜细胞（mesangial cell,MC）作为离体研究模型,db/db鼠和链佐星-弗氏完全佐剂（streptozotocin-complete Freund’sadjuvant,STZ-CFA）联合诱导的DN模型作为整体动物模型,研究了UCN对抗DN发展的作用及可能的作用机制。本文的第一部分采用了体外糖基化终产物（advanced glycationend products,AGEs）生成实验和MC作为研究对象,研究了UCN对AGEs生成及高糖/AGEs作用下MC增殖、组织转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）、Ⅳ型胶原（collagen typeⅣ,collaⅣ）表达的影响,及对TGF-β1作用下血管肉皮生长因子（vascularendothelium growth factor,VEGF）分泌的影响。以荧光法测定AGEs的生成,3H-TDR掺入法测定细胞增殖状态,免疫细胞化学法测定TGF-β1、CTGF、collaⅣ的表达,ELISA测定VEGF的分泌。结果表明,UCN对AGEs生成没有明显影响,但可以抑制高糖/AGEs诱导的MC的异常增殖和TGF-β1、CTGF、collaⅣ的过度表达和TGF-β1诱导的VEGF过度分泌。而CRF受体阻断剂astressin（AS）能减弱UCN的上述作用。本文第二部分研究了UCN对db/db鼠肾病动物模型DN发展的影响。采用公认的2型DN模型db/db鼠为研究对象,给药六周,连续监测了UCN对血糖、体重、进食量的影响,并检测了UCN对db/db鼠血浆胰岛素、尿素氮（blood urine nitrogen,BUN）、肌酐（creatinine,Crea）、AGEs、红细胞内山梨醇（sorbitol,SB）含量、肾组织匀浆中超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、丙二醛（malonaldehyde,MDA）水平的影响及对肾组织病理学、肾小球ECM沉积的影响。结果表明,UCN对模型动物血糖、进食量、血浆胰岛素水平没有明显影响,但从给药第三周起能够降低模型动物体重,并且能降低血浆BUN、Crea、AGEs水平、红细胞内SB含量、肾匀浆中MDA含量,提高肾匀浆中SOD活性,减轻肾小球病理变化及肾小球系膜基质聚积和系膜区扩张。AS除不能对抗UCN降低红细胞内SB含量的效应外,可逆转UCN对抗db/db鼠肾病发展的保护作用。本文第三部分研究了UCN对STZ-CFA联合诱导的糖尿病模型大鼠DN发展的影响。采用STZ-CFA联合诱导辅以高脂饮食,连续喂养14周制作DN模型。连续给药8周（自实验开始第7周起给药）,监测UCN对体重、血糖的影响;生化检测UCN对血清血糖、胰岛素（放免）、BUN、Crea、总胆固醇、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、SOD、MDA水平的影响,收集24 h尿液,测定尿液体积、尿液中Crea、尿素氮、尿微量白蛋白（放免）水平,计算肌酐清除率;观察了UCN对肾脏病理组织学的影响及对系膜基质聚积的影响;免疫组织化学方法研究了肾小球TGF-β1、CTGF、VEGF的表达,RT-PCR方法检测肾组织VEGF mRNA的表达。结果表明,UCN对DN大鼠血糖、胰岛素、体重没有明显影响,但减轻肾脏重量;可以改善DN状态下的脂代谢紊乱:降低血清总胆固醇、LDL水平,提高HDL水平;改善氧化还原失衡状态:提高血清SOD水平、降低血清MDA水平,降低血清AGEs水平和红细胞内SB含量;改善肾脏功能:减少24 h尿液体积和微白蛋白排出量,提高尿液尿素氮、Crea水平,降低血清BUN、Crea水平,提高肌酐清除率（creatinine clearance rate,Ccr）;减轻肾小球胞外基质聚积和系膜区增宽程度,抑制肾小球TGF-β1、CTGF、VEGF、VEGF mRNA、collaⅣ的过度表达。除对SB的影响外,AS能够减弱UCN对STZ-CFA诱导的DN模型的作用。此外,本文还研究了STZ-CFA辅以高脂饮食诱导的DN模型肾脏UCN表达的变化。采用RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测UCN mRNA和UCN在肾脏组织的表达。结果表明,UCN mRNA在DN模型大鼠肾脏表达有增加的趋势,但无统计学意义,而UCN在肾脏组织中的蛋白表达水平没有明显差异,由于时间所限,此结果仅为初步结果,尚需进一步实验研究。综上所述,UCN能够改善肾脏功能,减少尿微白蛋白排出,这与UCN通过多途径对抗DN发展的机制有关:抑制MC异常增殖,抑制促纤维化因子（TGF-β1、CTGF、VEGF、VEGF mRNA）的过度表达从而抑制肾小球ECM聚积和系膜基质增生（collaⅣ）,减少AGEs堆积、抑制PP活性、纠正机体氧化还原失衡,降低血清总胆固醇、LDL、提高HDL水平。除对SB的影响外,UCN改善DN的作用与CRF受体相关。此外,UCN在DN肾脏中表达变化,尚需更多的数据支持。
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